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Jul 21, 2023

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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12383 (2023) Cite este artículo 193 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics Los esferoides tumorales multicelulares incrustados en matrices de colágeno I son comunes in vitro

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12383 (2023) Citar este artículo

193 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

Los esferoides tumorales multicelulares incrustados en matrices de colágeno I son sistemas in vitro comunes para el estudio de tumores sólidos que reflejan el entorno fisiológico y las complejidades del entorno in vivo. Si bien los entornos de colágeno I son fisiológicamente relevantes y permisivos para la invasión celular, el estudio de esferoides en tales hidrogeles presenta desafíos para ensayos analíticos clave y para una amplia gama de modalidades de imágenes. Si bien esto se debe en gran medida al grosor de los hidrogeles 3D que en otras muestras normalmente se puede superar mediante seccionamiento, debido a su naturaleza altamente porosa, los hidrogeles de colágeno I son muy difíciles de seccionar, especialmente de una manera que preserve la red de hidrogel que incluye las células. Patrones de invasión. Aquí, describimos un método novedoso para preparar y crioseccionar esferoides invasivos en una matriz de dos componentes (colágeno I y gelatina), una técnica que denominamos crioseccionamiento de esferoides in vitro de doble hidrogel de muestras tridimensionales (DISC-3D). DISC-3D no requiere fijación celular, preserva la arquitectura de los esferoides invasivos y su entorno, elimina los desafíos de obtención de imágenes y permite el uso de técnicas que rara vez se han aplicado en el análisis de esferoides tridimensionales, incluida la microscopía de superresolución y las imágenes de espectrometría de masas. .

El estudio in vitro de células cultivadas en sustratos planos bidimensionales (2D) se ha utilizado durante más de un siglo y ha sido crucial en innumerables descubrimientos científicos. Si bien el cultivo celular 2D sigue siendo un método estándar en biología molecular y celular, desde hace tiempo se sabe que no puede recapitular aspectos críticos de los sistemas in vivo, incluidas las interacciones tridimensionales (3D) entre célula y célula-entorno1. Estas interacciones son particularmente importantes en el estudio de procesos celulares que son explícitamente emergentes y multicelulares; por ejemplo, en el desarrollo y crecimiento y progresión de tumores sólidos.

En los últimos años se ha empleado cada vez más el cultivo celular en 3D2. Aquí, las entidades multicelulares se cultivan o preparan a partir de líneas celulares o tejido del paciente (normalmente denominados esferoides y organoides, respectivamente) y se cultivan en hidrogeles sintéticos o naturales que imitan la matriz extracelular in vivo. Se ha demostrado que el cultivo celular tridimensional replica mejor la fisiología del tejido humano, como los gradientes de nutrientes y oxígeno, las diferentes zonas proliferativas y las interacciones célula-célula y célula-matriz, lo que proporciona una justificación clara para utilizar el cultivo 3D para estudiar cuestiones biológicas que son de naturaleza multicelular3,4,5,6. Entre los hidrogeles 3D, los entornos de colágeno I muestran una relevancia fisiológica particular para muchos tumores sólidos. En el cáncer de mama, la alta densidad de colágeno I es un factor de riesgo conocido para desarrollar la enfermedad7,8 y la densidad particular y la organización auricular de las fibras de colágeno alrededor de los tumores se asocian con el pronóstico9. Las interacciones entre las células y el microambiente estromal rico en colágeno también son importantes en el cáncer de páncreas10,11 y se han implicado en una variedad de otros cánceres12. El colágeno I también es un entorno atractivo para el cultivo celular en 3D, ya que su bioquímica y estructura de red favorecen una invasión celular eficiente. Además, es un entorno en el que las propiedades físicas, como el ancho de la fibra, el tamaño de los poros y la rigidez del hidrogel, se pueden ajustar fácilmente sin alterar la composición bioquímica, lo que permite estudiar los efectos de estas propiedades sobre el modo y la eficiencia de invasión celular13,14,15,16 .

A pesar de que está bien establecido que el cultivo celular en 3D, y los hidrogeles de colágeno I en particular, proporcionan un alto grado de relevancia fisiológica y oportunidades para separar la importancia de la bioquímica de las propiedades físicas en el comportamiento celular, la adopción del cultivo celular en 3D ha sido relativamente lento. La desgana se debe, en parte, a los desafíos asociados con la adquisición de imágenes de microscopía óptica de alta resolución en tales entornos6. Las células perciben y responden a la rigidez ambiental en distancias de al menos decenas de micras, y posiblemente más de cien micras17. Como tal, para que las células se comporten como lo harían en un entorno 3D isotrópico, deben ubicarse muy por encima de los sustratos rígidos de imágenes. Esto puede dar como resultado que las células estén más allá de la distancia de trabajo de los objetivos típicos de alta apertura numérica, una señal de fondo alta debido a la dispersión desde fuera del plano de imagen y autofluorescencia de las células o del hidrogel que las rodea. Además, el entorno 3D puede dificultar la difusión de pequeñas moléculas o anticuerpos a través de la muestra, inhibiendo tanto los estudios de fármacos como la introducción de etiquetas fluorescentes en estos contextos. Los desafíos asociados con las muestras 3D pueden ser especialmente graves en los enfoques más ricos en información, como las imágenes ópticas de súper resolución, donde la relación señal-ruido es primordial, los enfoques correlativos en los que se emplean múltiples modalidades y los enfoques no ópticos como la espectrometría de masas. imágenes donde la dispersión de muestras gruesas impide la recopilación de datos, excepto en la superficie de la muestra.

Al igual que en el tejido, el corte se puede utilizar en muestras de hidrogel 3D para aliviar estos problemas. Desafortunadamente, algunas de las mismas propiedades que hacen que el colágeno I sea permisivo para la invasión celular también lo hacen poco adecuado para el seccionamiento. En particular, los geles de colágeno I son débiles, con módulos de almacenamiento típicamente de 10 a 100 Pa para las preparaciones utilizadas en experimentos de invasión celular13,14. Junto con la naturaleza microporosa de las redes de hidrogel de colágeno I, esto hace que los geles sean particularmente propensos a colapsar al seccionarlos. La demostración de la sección de hidrogeles de colágeno I 3D que contienen células es rara18,19, aunque se puede lograr la sección de núcleos de esferoides (que carecen de una matriz competente para la invasión)20,21,22,23. Si bien es informativa, la investigación de los núcleos de esferoides por sí sola impide la investigación de los patrones migratorios celulares, las interacciones celulares con las proteínas de la matriz extracelular y las cascadas metastásicas asociadas con la migración de las células cancerosas. Más allá de esto, los agentes de inclusión típicos pueden presentar desafíos para experimentos particulares. La inclusión en parafina afecta la antigenicidad de las proteínas, inhibiendo el marcaje basado en anticuerpos24,25 y al mismo tiempo requiere una deshidratación de la muestra que altera la estructura de la red del hidrogel. La inclusión en un compuesto de temperatura de corte óptico (OCT) da como resultado muestras fácilmente seccionadas19,26 pero es incompatible con los experimentos de espectrometría de masas, ya que uno de los componentes principales de la OCT, el polietilenglicol, produce iones que compiten con los iones endógenos de moléculas pequeñas, lo que resulta en una disminución significativa de intensidad y calidad del espectro27,28. Además, los métodos de corte que se han utilizado previamente en células con una matriz competente para la invasión18,19 se han basado en la fijación celular, lo que interfiere con una variedad de enfoques analíticos, incluidas las imágenes de lípidos por espectrometría de masas y los análisis lipidómicos relacionados, ya que los protocolos de fijación se lavan. elimina varios metabolitos y lípidos pequeños29,30,31.

Aquí, describimos un método novedoso para preparar y crioseccionar esferoides en una matriz de dos componentes (colágeno I y gelatina), una técnica que denominamos crioseccionamiento de esferoides in vitro de doble hidrogel de muestras tridimensionales (DISC-3D). Esta técnica aprovecha el hecho de que la gelificación del colágeno I se produce al aumentar la temperatura, mientras que la de la gelatina se produce al disminuir la temperatura, lo que permite la gelificación en serie de las redes interpenetrantes con temperatura controlada. El protocolo DISC-3D apoya la proliferación e invasión celular, y la integridad de las células individuales y de la matriz extracelular circundante se preserva durante el corte. Además, el protocolo no interfiere con la antigenicidad de las proteínas y no requiere fijación (aunque es compatible con ella), lo que permite investigar las distribuciones de lípidos en células invasivas. Como tal, además de permitir una variedad de microscopías ópticas, incluidas microscopías de súper resolución, el protocolo DISC-3D permite la obtención de imágenes por espectrometría de masas de esferoides invasivos.

Como se muestra esquemáticamente en la Fig. 1 y la Fig. S1, el protocolo DISC-3D consiste en formar un esferoide, colocarlo en una solución de colágeno I que se gelifica alrededor del esferoide, permitiendo que el esferoide invada y cubriéndolo con una gelatina. solución que se difunde a través de la muestra antes de la gelificación de la gelatina. Esto crea una red dual interpenetrante de colágeno I/hidrogel de gelatina alrededor del esferoide. En este punto, las muestras están listas para congelarse y crioseccionarse.

Protocolo DISCO-3D. Los esferoides se forman en presencia de perlas de poliestireno marcadas con fluorescencia, que proporcionan una señal visual para localizar los esferoides en pasos posteriores. Los esferoides se colocan en soluciones de colágeno I que se dejan gelificar. Después de la implantación del esferoide y la invasión celular inicial, las muestras se cubren con gelatina caliente. Se deja que la gelatina se difunda a través de la muestra durante 24 h mientras las células continúan invadiendo y luego se gelifica durante 1 h a 4 °C antes de la congelación instantánea. Luego, la muestra se puede crioseccionar y obtener imágenes mediante una variedad de técnicas. Las variaciones del procedimiento optimizado para distintos experimentos se describen en Métodos y en la Fig. S1. En la Fig. S2b,c se muestra un esferoide representativo sometido al protocolo DISC-3D y obtenido imágenes mediante microscopía de campo claro en los dos puntos del protocolo descritos en cuadros azules.

La combinación de colágeno I y gelatina resulta especialmente atractiva por varias razones. En primer lugar, la gelatina es colágeno desnaturalizado, lo que garantiza que las células estén expuestas a uno de los entornos bioquímicos más simples posibles con este enfoque. Fundamentalmente, mientras que el colágeno pasa por una transición sol-gel al calentarse, la gelatina lo hace al enfriarse. Esto permite el autoensamblaje en serie de las dos redes con cambios de temperatura. Además, se ha descubierto que la gelatina no afecta la invasión celular mientras está en solución (Fig. S2), por lo que el momento de la adición de gelatina y el tiempo necesario para su difusión a través de la muestra no inhibe el estudio de la invasión y las células invadidas. Finalmente, el protocolo DISC-3D aborda la necesidad de un andamio bifuncional con dos tamaños de poro distintos. Mientras que el colágeno I se autoensambla en fibras con un tamaño de poro del orden de micras, una estructura de red que apoya en gran medida la invasión celular, la gelatina forma una red nanoporosa. La gelatina nanoporosa proporciona a la matriz propiedades físicas adecuadas para la criosección a diferencia de un hidrogel de colágeno I (de un solo componente) altamente poroso. Dado que es posible la crioseccion de esferoides, incluidos los esferoides invasivos, el protocolo DISC-3D permite una serie de experimentos que antes no eran factibles para tales muestras. Si bien la Fig. 1 muestra una implementación del protocolo DISC-3D, el protocolo se puede adaptar para adaptarse a diferentes necesidades experimentales, cuyos ejemplos se describen en Métodos y se representan esquemáticamente en la Fig. S1.

La mayor complejidad del cultivo 3D plantea desafíos únicos para la detección y cuantificación sensibles de objetivos celulares de interés. En un entorno tan poblado, la detección de antígenos diana puede verse limitada por la difusividad de la sonda a través de regiones densas de células y la matriz extracelular circundante, así como por la pérdida de señal debido a la dispersión de la luz de muestras más gruesas. Si bien la sección integrada tradicional puede aliviar este problema, no existen técnicas adecuadas para la gama completa de experimentos de imágenes de espectrometría de masas y ópticas que deseamos realizar. Entre otras cosas, el protocolo DISC-3D aprovecha la preservación superior del antígeno de los métodos de crioseccionamiento sobre los enfoques basados ​​en parafina para facilitar técnicas de imágenes de alto contenido y alta resolución que normalmente son desafiantes en muestras 3D. Esto se ilustra primero en la Fig. 2, que muestra un único esferoide de cáncer de mama MDA-MB-231 preparado usando el protocolo DISC-3D y (antes de la invasión) fijado y teñido con faloidina: AlexaFluor567 (una pequeña molécula conjugada fluorescente que se une a actina f celular), DAPI (una pequeña molécula fluorescente que se intercala en el ADN) y un anticuerpo de integrina anti-β1 directamente conjugado (clon P5D2) marcado con AlexaFluor488. El flujo de trabajo asociado con este experimento se muestra en la Fig. S1b. Las imágenes ópticas de este esferoide se obtuvieron por primera vez antes de agregar gelatina y crioseccionar (Fig. 2a-c, fila superior) para permitir la comparación de la calidad de la imagen antes y después de la sección. Se tomaron imágenes a lo largo de la dimensión axial del esferoide intacto cada 10 μm y se muestran imágenes representativas del esferoide cada 100 μm. Estas imágenes (Fig. 2a – c, fila superior) y los perfiles de intensidad asociados obtenidos a partir de ROI lineales dibujadas en el centro de cada núcleo esferoide (Fig. 2d – f) revelan que, si bien los tres fluoróforos se pueden visualizar en la periferia del esferoide con microscopía de fluorescencia confocal, no se ve ninguno en el núcleo del esferoide. Esto es particularmente digno de mención en el caso de DAPI, que debería tener una distribución uniforme a través del esferoide. La aparente localización de DAPI en la periferia del esferoide indica una difusión limitada del tinte a través del esferoide y/o pérdida de señal debido a una excitación ineficiente y/o recolección de fluorescencia del núcleo del esferoide. En un intento por combatir estas dificultades, este esferoide pasó por los pasos finales del protocolo DISC-3D, lo que dio como resultado secciones de 10 μm de espesor. Las imágenes posteriores al corte revelan fluorescencia en toda la dimensión axial del esferoide, así como en toda la dimensión radial, aunque todavía se observa una mayor intensidad en la periferia del esferoide para varios de los tintes, como es particularmente evidente en los cortes obtenidos desde lo más profundo del esferoide. Estas observaciones sugieren que la falta de señal interior en muestras 3D obtenidas mediante microscopía confocal puede atribuirse en parte a la pérdida de señal fluorescente debido a la dispersión de la luz, pero también se debe en parte a la mala penetración de las etiquetas fluorescentes a través de la densa muestra 3D. Como tal, este mismo esferoide, que ya había pasado por el procedimiento DISC-3D completo, incluida la criosección, se volvió a teñir con cada uno de estos tintes y se tomaron imágenes (Fig. 2a-c, fila inferior). Estas imágenes muestran una tinción relativamente uniforme de DAPI en todo el esferoide en el plano xy para todos los cortes (Fig. 2j). Por lo tanto, se puede concluir que las imágenes de fluorescencia confocal obtenidas del esferoide original se vieron afectadas por limitaciones en la profundidad de la imagen, la dispersión de la excitación y/o emisión en la muestra, y la permeabilidad de la muestra y la difusión del tinte. Las imágenes de faloidina marcada en las muestras reteñidas también muestran una tinción relativamente uniforme en todo el esferoide (Fig. 2k), lo que coincide con la expectativa de que la actina F esté presente en cantidades similares en todas las células. La Figura 2n muestra que no hay diferencia estadística entre las imágenes iniciales de faloidina DISC-3D y las imágenes de faloidina DISC-3D reteñidas, lo que sugiere que la faloidina, a diferencia de DAPI, penetró completamente en la muestra en el contexto 3D.

Comparación de calidad de imagen en dimensiones laterales y axiales. Todos los datos aquí se obtuvieron del mismo esferoide MDA-MB-231, que se preparó siguiendo el protocolo DISC-3D descrito en la Fig. S1b y se marcó con fluorescencia con DAPI (azul), faloidina (rojo) y anticuerpo anti-integrina β1. (verde). (ac) Imágenes de esferoides recopiladas (fila superior) con microscopía de fluorescencia confocal en 3D, (fila central) siguiendo el protocolo DISC-3D que incluye crioseccionamiento (cortes de 10 μm) y (fila inferior) después de una nueva tinción después del protocolo DISC-3D . Las etiquetas indican la profundidad del esferoide en el que se recopiló la imagen. La fila superior de ac solo muestra cortes a 100 y 200 μm, ya que la distancia de trabajo del objetivo impidió obtener imágenes más profundas de la muestra. Barra de escala = 200 μm. (d – j) Perfiles de intensidad de un ROI lineal dibujado desde un borde del esferoide al otro [línea amarilla en el esferoide en la parte superior izquierda en (a)] para todas las imágenes que se muestran en (a – c), con imágenes en 3D representadas en (d – f), datos crioseccionados de DISC-3D representados en (g – i) y datos reteñidos de DISC-3D representados en (j – l). La intensidad se normaliza a la intensidad máxima en ese perfil de intensidad. ( m – o ) Señal promediada a través de perfiles de intensidad normalizados y cortes a través del esferoide en muestras reteñidas 3D, DISC-3D y DISC-3D para (m) DAPI, (n) faloidina y (o) integrina β1 respectivamente. Observamos que dicha comparación subestima la diferencia entre las imágenes 3D tradicionales y DISC-3D, ya que las imágenes 3D tradicionales solo se evalúan a 100 y 200 μm en la muestra. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, †p > 0,05 (n = 12, 59 y 46 cortes para 3D, DISC-3D y DISC-3D reteñidos, respectivamente).

Las sondas basadas en anticuerpos sufren problemas de penetración de muestras similares a los de sus homólogas de moléculas pequeñas. La tinción de la integrina β1 demuestra una fuerte acumulación de esta proteína en la periferia del esferoide en imágenes 3D y DISC-3D (Fig. 2c, dos filas superiores), lo que indica una mala penetración de anticuerpos. Aunque se podrían esperar altas concentraciones de integrina β1 en la interfaz colágeno-esferoide, trabajos anteriores han demostrado que las integrinas β1 también están involucradas en las adherencias célula-célula mediadas por la matriz extracelular en todo el interior del esferoide32,33. De hecho, la nueva tinción de las muestras DISC-3D revela que esto es cierto, con la integrina β1 encontrada en todo el núcleo del esferoide (Fig. 2c, fila inferior; Fig. 2l, o). El conjunto de resultados que se muestra en la Fig. 2 demuestra cómo el protocolo DISC-3D, especialmente cuando se combina con la tinción después del corte, puede revelar detalles críticos pero oscurecidos de la distribución molecular en una muestra que podrían interpretarse incorrectamente si se abordaran solo mediante tinción y/o o imágenes en 3D. Además, dadas las diferencias en la eficiencia de penetración de la sonda observadas aquí (en las que la mala penetración aparentemente no es exclusiva de las sondas más voluminosas), está claro que puede ser difícil predecir situaciones en las que se producirán problemas de penetración del tinte, lo que destaca la utilidad del DISC- Protocolo 3D seguido de tinción para identificar correctamente la distribución molecular en muestras 3D.

Además de mejorar la calidad de la imagen de muestras 3D marcadas con fluorescencia, el protocolo DISC-3D facilita el uso de estrategias de etiquetado fluorescente que son poco prácticas o imposibles de llevar a cabo en muestras 3D in vitro típicas debido a una señal limitada, baja señal de fondo y/o Pobre penetrabilidad de la muestra. Muchos anticuerpos conjugados directamente e incluso ocasionalmente pequeñas moléculas marcadas con fluoróforos entran en este grupo; Además, el etiquetado secundario de anticuerpos casi siempre falla en esferoides cultivados en hidrogeles 3D. Si bien existen algunos informes sobre el uso de anticuerpos secundarios en muestras 3D seccionadas, los métodos empleados requieren pasos de deshidratación, fijación e inclusión que normalmente no preservan la integridad del frente invasivo de un esferoide34,35.

Aquí, los esferoides se tiñeron con tres tintes que se usan regularmente en cultivos celulares 2D pero que no se han usado con éxito en nuestro laboratorio en muestras de esferoides 3D y para los cuales no encontramos evidencia en la literatura de un etiquetado exitoso en muestras 3D que respalden la invasión celular. Específicamente, intentamos visualizar MT1-MMP, RhoA y p53 a través de anticuerpos conjugados directamente (MT1-MMP) o una combinación de anticuerpos primarios y secundarios marcados con fluorescencia (RhoA y p53) en células en el frente invasivo de un esferoide. Para MT1-MMP, la principal dificultad es presumiblemente los bajos niveles de proteína diana presentes y su ubicación cerca o en el entorno extracelular, donde la señal de fondo puede ser particularmente alta. Para RhoA y p53, se intentó un etiquetado secundario. El etiquetado secundario es un enfoque conveniente en los casos en los que los anticuerpos conjugados directamente no están disponibles comercialmente y proporciona una valiosa amplificación de la señal para objetivos de baja abundancia. Aquí, el desafío principal es la naturaleza de dos pasos del etiquetado secundario que requiere una penetración en serie efectiva de dos moléculas grandes a través de la muestra. Como lo demuestra la Fig. 3b-d, las imágenes obtenidas usando estos tintes en enfoques 3D muestran una señal baja al fondo, mientras que las obtenidas mediante tinción después de seccionar usando el protocolo DISC-3D tienen una señal significativamente mayor al fondo (Fig. 3f-k). También observamos que el fenotipo de las células invasivas se mantiene en las muestras DISC-3D, algo que, hasta donde sabemos, solo se ha demostrado una vez anteriormente para células invasivas en un hidrogel 3D después del corte19.

DISC-3D mejora la resolución y la localización precisa. (a – h) Esferoides invasivos MDA-MB-231 fotografiados mediante microscopía de fluorescencia confocal (a – d) en 3D o (e – h) después de la preparación de DISC-3D (cortes de 10 μm). ( a, e ) Esferoides ejemplares marcados con DAPI (cian) y con colágeno I también marcados con fluorescencia (verde). Se adquirieron imágenes de células individuales en el borde anterior del frente esferoide invasivo, como se muestra en los cuadros blancos, así como en los paneles (b – d) y (f – h). (b – d, f – h) Células invasoras representativas de esferoides marcadas con DAPI (cian) y (b, f) anti-RhoA (rojo, secundario), (c, g) anti-p53 (magenta, secundario), o (d,h) anticuerpos anti-MT1-MMP (verdes, conjugados directamente). En todos los casos, se adquirieron imágenes de células individuales en el borde anterior del frente esferoide invasivo, como las resaltadas por los cuadros blancos en (a,e). ( a, e ) Imágenes de microscopía confocal estándar; (b – d, f – h) son imágenes de Airyscan. (i – k) Relación señal a fondo de las muestras 3D y DISC-3D etiquetadas para (i) RhoA, (j) p53 y (k) MT1-MMP. Para MT1-MMP, la señal de fondo se evaluó tanto en la membrana celular como en el entorno inmediato alrededor de la célula, donde se excreta MT1-MMP. Barra de escala = 200 μm en (a, e) y 10 μm en (b – d, f – h); *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, †p > 0,05.

Es importante destacar que la microscopía confocal de esferoides DISC-3D muestra distribuciones moleculares que son consistentes con las reportadas en la literatura, mientras que las imágenes confocales de muestras 3D intactas no lo hacen. Por ejemplo, RhoA debe estar anclada a la membrana celular para poder activarse y, como tal, se espera que esté localizada principalmente en la membrana, particularmente en las células invasoras36,37. Debido a la mala señal del fondo en las células teñidas con el hidrogel 3D y obtenidas imágenes con un enfoque confocal tradicional, la intensidad de RhoA está apenas por encima del fondo (Fig. 3d) y la localización del fluoróforo es difícil de determinar a partir de estas imágenes. Por el contrario, las células invasivas visualizadas siguiendo el protocolo DISC-3D muestran una localización clara de RhoA en la membrana celular (Fig. 3f). Del mismo modo, p53 se une directamente al ADN y, por tanto, se espera que se localice principalmente en el núcleo celular, como se ha demostrado habitualmente en muestras 2D38. La imagen 3D tradicional no muestra esta localización (Fig. 3c), mientras que las muestras DISC-3D muestran la proteína confinada al núcleo (Fig. 3g). Finalmente, MT1-MMP existe tanto como proteína transmembrana como excretada y soluble39,40. En la imagen 3D tradicional, no se puede ver ninguna proteína en el entorno extracelular, e incluso es difícil determinar la localización del tinte dentro de la célula dada la baja relación señal-fondo (Fig. 3d). Por el contrario, la localización de MT1-MMP en la membrana y en el entorno local de las células invasivas es evidente en muestras preparadas mediante el protocolo DISC-3D (Fig. 3h).

Dada la posibilidad de teñir y obtener imágenes de muestras DISC-3D después de la crioseccion, también evaluamos el período de tiempo durante el cual la tinción y las imágenes se podrían realizar con alta fidelidad. Para evaluar la longevidad de la muestra, preparamos un esferoide mediante fijación, congelación, criosección y tinción. Luego la muestra se colocó en una bolsa hermética con desecante durante más de 10 meses a 4 °C. Después del período de almacenamiento, la muestra se colocó en un desecador a temperatura ambiente durante 1 h y luego se tomaron imágenes (Fig. S3). La muestra no mostró degradación aparente y la intensidad de la señal y la localización del fluoróforo fueron las esperadas. Además, después del período de almacenamiento de 10 meses, se añadió un tinte adicional (faloidina) a la muestra para evaluar si se podía lograr el etiquetado después de un almacenamiento a largo plazo. La Figura S3 muestra que dicho etiquetado es adecuado para visualizar actina en la muestra, lo que indica la preservación a largo plazo de la estructura celular y subcelular en muestras preparadas de esta manera. La capacidad de teñir muestras después del protocolo DISC-3D y el almacenamiento a largo plazo permite el interrogatorio de seguimiento de las muestras después, por ejemplo, del desarrollo de nuevas hipótesis y la identificación de nuevos objetivos de etiquetado.

Un componente esencial del método DISC-3D es la preservación de la arquitectura básica del andamio en el que están incrustadas las células. Aunque los experimentos de control demuestran que la red interpenetrante de gelatina-colágeno apoya la invasión celular de una manera comparable a los geles de colágeno I puro (Fig. S2), investigamos más a fondo la estructura de los hidrogeles seccionados DISC-3D mediante microscopía óptica para confirmar que el colágeno La red de fibras, cuya estructura microporosa fibrilar es fundamental para la invasión celular, permaneció intacta después del procesamiento y corte de la muestra. Para simplificar el análisis de la red fibrilar, empleamos hidrogeles desnudos (libres de esferoides) compuestos de colágeno I y gelatina, preparados de acuerdo con el protocolo DISC-3D. Más allá de validar la estructura de la red, estas mediciones también proporcionaron un banco de pruebas conveniente para la evaluación de la calidad de la imagen de muestras 3D y DISC-3D a través de una variedad de técnicas de microscopía óptica, ya que las fibras de colágeno formadas en las condiciones utilizadas aquí tienen un diámetro bastante uniforme de 50 a 100 nm15 .

La Figura 4a muestra imágenes representativas de colágeno utilizando cinco técnicas de microscopía de fluorescencia: campo amplio, microscopía confocal, microscopía Airyscan, microscopía de iluminación estructurada en celosía (SIM) y microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM). Los últimos tres enfoques se consideran técnicas de superresolución: las imágenes Airyscan mejoran la resolución mediante un detector de elementos múltiples y la deconvolución, el SIM de celosía recupera información de alta resolución mediante el uso de una rejilla de difracción y STORM es una técnica de superresolución basada en la localización. que mejora la resolución a través de imágenes secuenciales de fluoróforos individuales41,42,43. La microscopía STORM se realizó con iluminación de lámina óptica laminada y altamente inclinada (HILO), una variación de la microscopía de reflexión interna total que aumenta la profundidad de penetración44.

(a) Imágenes de colágeno I tomadas (arriba) en 3D ≈ 10 μm por encima del cubreobjetos [3D bajo], (centro) en 3D > 100 μm en el gel [3D alto] y (abajo) después de la preparación de DISC-3D (4 rebanadas de μm). De izquierda a derecha, las columnas muestran imágenes tomadas con microscopía de campo amplio, microscopía confocal, imágenes Airyscan, SIM de celosía y STORM en una implementación HILO. No se presenta ninguna imagen para imágenes 3D STORM en las dos filas superiores porque (3D bajo) el filtrado de luz fuera del plano fue insuficiente o (3D alto) la técnica no se pudo implementar a tales profundidades. Barra de escala = 20 μm. (b) Ancho total medio medido a la mitad del máximo (FWHM) de fibras de colágeno de cada técnica de microscopía. Las barras de error muestran la desviación estándar. El FWHM mínimo esperado de cada aproximación se muestra mediante líneas horizontales discontinuas. (c) Tamaño de poro de las redes de colágeno determinado mediante técnicas de imagen y preparaciones de muestras (consulte Métodos para obtener más detalles). Las barras de error muestran la desviación estándar. En la Fig. S4 se proporciona la importancia estadística, el número de muestras evaluadas e información adicional sobre la resolución de cada técnica.

Para cada técnica, se recogieron imágenes de fibras de colágeno cerca del sustrato (10–25 μm en el gel, denominado 3D bajo, fila superior), muy por encima del sustrato (> 100 μm en el gel, denominado 3D alto, fila del medio), y después de la preparación y criosección de DISC-3D (fila inferior). Todos los geles investigados se sometieron a la primera parte del protocolo DISC-3D, la adición y gelificación de gelatina. Por lo tanto, la única diferencia entre las muestras de las imágenes DISC-3D (fila inferior) y las otras muestras (filas superior e intermedia) es que las muestras DISC-3D se congelaron, se retiraron de los pocillos de muestra y se seccionaron. Primero, observamos que cualitativamente, las imágenes del hidrogel recolectadas cerca del cubreobjetos parecen similares a las imágenes de muestras DISC-3D en todas las técnicas, lo que sugiere que la estructura del hidrogel no se ve afectada negativamente por el procedimiento de preparación de muestras DISC-3D. Generalmente, las muestras DISC-3D muestran mejoras en la calidad de la imagen para todas las técnicas de microscopía exploradas. La microscopía de campo amplio, que sufre una señal fuera del plano para muestras 3D, muestra ganancias obvias en la calidad de la imagen para las muestras DISC-3D en relación con las muestras 3D intactas (Fig. 4a, columna más a la izquierda). La microscopía confocal, Airyscan y SIM, si bien proporcionan una calidad de imagen excelente y revelan una morfología de fibra consistente en un nivel bajo en gel, también muestran disminuciones en la calidad de la imagen a mayores profundidades de imagen (Fig. 4a). Observamos que las imágenes a tales profundidades garantizan que las células interrogadas no detecten el sustrato rígido subyacente; por lo tanto, maximizar la calidad de la imagen en esta región es fundamental para estudiar el comportamiento celular en un contexto fisiológicamente relevante. Las imágenes de STORM eran deficientes y las fibras eran difíciles de discernir tanto en las partes bajas como en las altas en los geles 3D, aparentemente debido a los desafíos del filtrado fuera de la emisión plana en esta muestra altamente dispersa, ya que dicho filtrado es fundamental para la identificación y localización de fluoróforos individuales. La mejora en la calidad de la imagen observada en las muestras DISC-3D abre la puerta a revelar detalles sobre la microestructura del sistema que de otro modo no serían accesibles en contextos culturales tradicionales en 3D.

De hecho, después de dicha evaluación cualitativa, cuantificamos tanto el ancho aparente de la fibra como el tamaño de los poros en las preparaciones y técnicas de muestras, ya que estas son las propiedades estructurales clave de la red de los hidrogeles de colágeno I45. El ancho aparente de la fibra se determinó a partir del ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de los ajustes gaussianos a los perfiles de intensidad a través de las fibras, considerando solo las fibras que se ajustaron bien con este método (R2> 0,95, Fig. S4a). Para la mayoría de las técnicas de microscopía exploradas aquí, encontramos anchos de fibra mayores que el espesor de fibra esperado de 50 a 100 nm, de acuerdo con las resoluciones medidas de estas técnicas (Fig. 4, Fig. S4c). Dado que el ancho real de la fibra cae por debajo de las resoluciones medidas para campo amplio, confocal, Airyscan y SIM, solo las imágenes STORM, que solo se pueden aplicar a muestras DISC-3D, pueden informar con precisión el espesor de la fibra (Fig. 4b). Aquí, encontramos un ancho de fibra de aproximadamente 75 nm en muestras DISC-3D, en buena concordancia con las mediciones mediante microscopía electrónica y microscopía de fuerza atómica46.

A continuación, evaluamos los tamaños de poro de los hidrogeles a través de métodos de imágenes y preparaciones de muestras, como se describe en Métodos. Para las muestras 3D, el tamaño de poro medido fue similar en todos los contextos de imágenes donde las imágenes fueron exitosas, arrojando un valor de ≈ 4 μm (Fig. 4c). Este tamaño de poro es similar al reportado previamente mediante microscopía de fluorescencia47 y algo más pequeño que el reportado previamente para geles de colágeno I de esta concentración y fuente biológica13; sin embargo, esas mediciones se realizaron mediante microscopía de reflectancia confocal, que es insensible a un subconjunto de fibras48, lo que produce una red aparentemente menos densa. Las muestras preparadas con DISC-3D produjeron tamaños de poro algo más pequeños que sus homólogos de gel 3D cuando se analizaron de la misma manera, con un tamaño de poro ≈ 3 μm (Fig. 4c). Las diferencias en la distribución del tamaño de los poros y el hecho de que las fibras se ven algo más curvadas y enredadas en las imágenes DISC-3D que en otras imágenes pueden reflejar un pequeño grado de colapso asociado con la manipulación de la muestra requerida para preparar la muestra para seccionar y/o el propio seccionamiento. En particular, encontramos que no se producen cambios en la estructura de la muestra al congelarla, pero sí se producen pequeños cambios al retirar los espaciadores de silicona que rodean la muestra, lo que debe realizarse antes de la criosección (Fig. S5). La extracción de los espaciadores de silicona puede alterar los puntos de anclaje de la red de colágeno que abarca la muestra, lo que provoca un pequeño grado de contracción y colapso del gel. Es posible que se produzcan perturbaciones adicionales durante el corte. A pesar de estas pequeñas diferencias, las muestras DISC-3D mantienen claramente la estructura microporosa de las redes de colágeno 3D, lo que brinda la confianza de que se pueden capturar imágenes detalladas de alta resolución de las interacciones célula-matriz extracelular y los cambios en la estructura de la red local durante la invasión mediante imágenes DISC-3D. Muestras 3D.

Habiendo demostrado la preservación de la estructura de la red y la accesibilidad óptica de las muestras DISC-3D, ahora evaluamos su idoneidad para otro poderoso método analítico, la obtención de imágenes por espectrometría de masas (MSI). Si bien se ha demostrado con éxito la MSI de núcleos de esferoides, hasta la fecha no se ha logrado tal caracterización del frente invasivo de un esferoide20. Una preocupación crítica con la obtención de MSI de muestras preparadas con DISC-3D es la baja densidad celular en el frente invasivo del esferoide, lo que a su vez conduce a una baja concentración de moléculas de interés en esa región. Para superar este desafío, se emplearon un prototipo de pulverizador modificado de alto rendimiento y un novedoso capilar de transferencia calentado (Fig. S6a), que permitió la recopilación de datos de MSI con el capilar de transferencia configurado a temperaturas desde temperatura ambiente hasta 400 °C. Las Figuras 5a-c muestran la intensidad de señal promedio en una sección de esferoide en el rango de 200 a 1000 m/z (Fig. 5a) y dos subconjuntos de este rango, la región de 300 a 500 m/z (Fig. 5b) y la de 700. —Región de 900 m/z (Fig. 5c). A medida que la temperatura aumenta a 350 °C, hay una ganancia significativa en la señal general, una tendencia que continúa a medida que la temperatura aumenta a 400 °C. Sin embargo, entre 350 y 400 °C también hay un aumento significativo de la señal en la región de 300 a 500 m/z. Esto, junto con el hecho de que la intensidad de la señal disminuye a 400 °C en el rango de 700 a 900 m/z, sugiere fragmentación de lípidos y proteínas. Por el contrario, la señal se maximiza a 350 °C en la región de 700 a 900 m/z, donde varias subclases de lípidos, incluida la mayoría de los triacilgliceroles y fosfatidilcolinas, tienen señales distintivas49,50. Esto sugiere que 350 °C es la temperatura ideal para recopilar datos de MSI en cortes de esferoides preparados mediante el protocolo DISC-3D, y detectamos varias clases de lípidos, incluidos ácidos grasos libres, fosfolípidos, esfingolípidos y glicerolípidos en estas secciones a esta temperatura. Esto está respaldado además por dos iones lipídicos de fosfatidilglicerol (PG) específicos detectados en m/z = 773,5338 (PG 36:2) y m/z = 747,5182 (PG 34:1), que se ha informado que están alterados significativamente en los cánceres de mama51 ,52. Estas señales no solo son de mayor intensidad sino que también su presencia en todo el frente invasivo es más evidente a 350 °C en relación con cualquier otra temperatura (Fig. S6c,d). En la Fig. 5d, e, se muestran espectros ejemplares que se centran en el régimen de 700–900 m/z recolectados a 24 °C y 350 °C, y en la Fig. 5 se muestran espectros ejemplares del rango completo de m/z en cada una de las temperaturas investigadas. T6e.

Imágenes por espectrometría de masas de muestras DISC-3D (cortes de 10 μm) de esferoides MDA-MB-231. Intensidad promedio de las señales de espectrometría de masas promediadas sobre secciones de esferoides a varias temperaturas en (a) todo el rango de 200 a 1000 m/z, (b) el rango de 300 a 500 m/z y (c) el rango de 700 a 900 m/z rango. Los resultados estadísticos que se muestran aquí se realizaron como muestras por pares. En la figura S6b se presenta una descripción completa de los resultados estadísticos. n = 8 en todos los casos excepto 150 °C, donde n = 7. *p < 0,05, †p > 0,05. ( d, e ) Espectros de masas normalizados representativos recopilados de esferoides invasivos siguiendo el protocolo DISC-3D a (d) 24 ° C y (e) 350 ° C que demuestran el aumento en la intensidad de la señal en el régimen ≈ 650–900 m / z. El número a la derecha de cada panel indica el pico de intensidad máxima a esa temperatura. (f) Imágenes representativas de espectrometría de masas preparadas siguiendo el protocolo DISC-3D descrito en la Fig. S1d, que muestran secciones consecutivas de esferoides individuales para varios iones de señal. En la primera sección en serie de cada ion de señal, el núcleo del esferoide está marcado con una línea de puntos blanca y el frente invasivo se indica con una línea de puntos roja. A la derecha se muestra la escala de colores desde la intensidad mínima hasta la máxima para los iones de señal. Barra de escala = 500 μm.

Utilizando el prototipo de tubo capilar calentado junto con el protocolo DISC-3D, obtuvimos lo que, hasta donde sabemos, son las primeras imágenes de espectrometría de masas de la distribución de lípidos en células de cáncer de mama que invaden in vitro (Fig. 5f). Curiosamente, estas imágenes revelan distribuciones espaciales de algunos iones lipídicos localizados sólo en el núcleo del esferoide, mientras que otros iones lipídicos están presentes tanto en el núcleo como en la región invasiva. Por ejemplo, observamos que los ácidos grasos libres como FA 16:1 (m/z = 253,2190) muestran una localización preferencial en el núcleo del esferoide, mientras que los fosfolípidos como las fosfatidilcolinas y las fosfatidiletanolaminas unidas a éter (m/z = 778,5570; PE O-40 :5) están presentes tanto en el núcleo como en el frente invasivo. Es particularmente interesante que algunos iones lipídicos aparentes en todo el esferoide son más intensos en la región invasiva a pesar de que la densidad celular es mucho menor en esa región que en el núcleo, lo que potencialmente revela nuevas firmas lipidómicas de células invasivas. Aquí identificamos iones de esfingomielina [SM 34:1; O2 (m/z = 703,5719), Fig. 5f, fila inferior y también SM 40:1; O2 (m/z = 787,6714)] que muestran dicha distribución, en consonancia con otros hallazgos que destacan el aumento de esfingomielinas de alto peso molecular en cánceres invasivos en relación con las células de cáncer de mama precancerosas cultivadas en 3D53.

Imágenes correlativas de cortes consecutivos de un esferoide invasivo preparado utilizando el protocolo DISC-3D descrito en la Fig. S1d que muestra (fila superior) DAPI obtenida mediante microscopía de fluorescencia confocal, (fila central) señal MSI a 778,5770 m/z con una escala de color lineal que se muestra en el panel derecho y (fila inferior) una imagen correlativa de las imágenes confocales y de MS. Barra de escala = 200 μm.

Además de permitir una amplia variedad de microscopías ópticas e imágenes de espectrometría de masas, la preparación de muestras DISC-3D facilita la microscopía correlativa entre estas técnicas. Esta microscopía correlativa entre instrumentos suele ser extremadamente desafiante en muestras 3D dado su tamaño y dimensionalidad, lo que resulta en un campo de búsqueda muy grande para regiones de interés identificadas. Si bien los marcadores fiduciales pueden mitigar estos desafíos, pocos marcadores fiduciales son apropiados tanto para MSI como para imágenes ópticas y ninguno ha sido evaluado en el contexto de esferoides invasivos54,55. Aquí, mostramos que DISC-3D facilita la microscopía correlativa entre instrumentos sin la necesidad de marcadores fiduciales al reducir efectivamente el espacio de búsqueda de 3D a 2D. La Figura 6 y la Figura S7 muestran una variedad de imágenes correlativas adquiridas con diferentes instrumentos y técnicas. Es de destacar que el registro se realiza con éxito sin marcadores fiduciales incluso en una muestra de solo hidrogel que tiene pocas características distintivas (Fig. S7).

La Figura 6 destaca que se pueden realizar imágenes correlativas de muestras DISC-3D a través de técnicas de imágenes ópticas y espectrométricas de masas, y esta figura muestra una imagen confocal de un esferoide invasor con células marcadas con el tinte nuclear DAPI y una imagen MSI de este esferoide. Estas imágenes correlativas ayudan en la interpretación de los datos de MSI, ya que las imágenes ópticas revelan claramente la densidad celular, las distribuciones y las zonas invasivas. De hecho, este enfoque podría usarse potencialmente para normalizar la señal de MSI en función de la densidad celular, ya que la normalización sigue siendo un problema desafiante en MSI56,57,58. Observamos que el etiquetado de células con DAPI requiere fijación y permeabilización celular, que son incompatibles con las imágenes de MSI, ya que los pasos de lavado requeridos eliminan muchos lípidos de interés. Como tal, esta muestra se preparó siguiendo el protocolo DISC-3D que se muestra en la figura S1d, se realizaron imágenes de espectrometría de masas y luego la muestra se fijó, permeabilizó y tiñó con DAPI para permitir la obtención de imágenes ópticas. Este procedimiento resalta que las muestras DISC-3D siguen siendo apropiadas para una caracterización adicional después de MSI, que generalmente se considera una técnica destructiva.

El protocolo DISC-3D permite el interrogatorio de muestras de esferoides invasivos en alta resolución, con enfoques de alto contenido. En este protocolo, el cultivo y la invasión de esferoides típicos van seguidos de la adición de una solución de gelatina que se toma a través de la transición sol-gel antes de la congelación instantánea y la crioseccion. El hidrogel dual de colágeno y gelatina es de naturaleza bifuncional y favorece tanto la invasión celular como la crioseccion. El procedimiento de sección preserva el patrón de migración de las células invasoras, así como la arquitectura de la matriz de colágeno, lo que permite el análisis de comportamientos celulares espacialmente heterogéneos y alteraciones locales de la microestructura de la matriz extracelular mediante una variedad de técnicas. Además, el protocolo DISC-3D no requiere fijación ni adición de componentes que puedan alterar la estructura de la muestra, la distribución molecular y la detección molecular. Esto agiliza las estrategias de etiquetado y permite la aplicación de imágenes ópticas de súper resolución y de espectrometría de masas, técnicas que generalmente no son posibles en cultivos celulares en 3D o con procedimientos de seccionamiento establecidos compatibles con esferoides invasivos.

Específicamente, el protocolo DISC-3D facilita el corte de hidrogeles 3D basados ​​en colágeno I que contienen esferoides invasivos, evitando desafíos asociados con el etiquetado y la obtención de imágenes en el contexto 3D que pueden conducir no solo a imágenes de mala calidad sino también a una comprensión incorrecta de la localización molecular en un muestra. Por ejemplo, demostramos que, si bien las imágenes confocales 3D sugieren una acumulación de integrina β1 en la superficie del esferoide (Fig. 2c, fila superior), las imágenes de estas muestras después de la preparación de DISC-3D muestran que esta aparente acumulación de integrina fue un artefacto causado por una mala difusión del anticuerpo y altos niveles de refracción en las muestras 3D intactas. Además, el protocolo DISC-3D permite un almacenamiento prolongado de la muestra antes de la tinción, lo que facilita el nuevo interrogatorio de la muestra cuando surgen nuevas hipótesis.

También mostramos que el protocolo DISC-3D preserva la estructura microporosa fibrilar del hidrogel de colágeno I, un requisito previo para el uso de enfoques basados ​​en imágenes para interrogar las interacciones célula-matriz extracelular, como las que ocurren durante la invasión celular. De hecho, el protocolo DISC-3D da como resultado una calidad de imagen mejorada de las características de la matriz de colágeno en una variedad de técnicas de microscopía óptica, incluidas técnicas de superresolución. Esto es especialmente obvio en lo profundo del gel, donde el sistema 3D in vitro es fisiológicamente más relevante.

Si bien las mejoras que DISC-3D aporta a las imágenes ópticas con respecto a las imágenes en muestras 3D nativas son sorprendentes, el protocolo DISC-3D aporta ventajas adicionales en relación con otras técnicas de corte, con una morfología de la muestra bien conservada en comparación con las técnicas de corte previamente establecidas, lo cual es especialmente importante. dada la naturaleza altamente porosa de los hidrogeles de colágeno. Fundamentalmente, el enfoque no requiere fijación de tejido ni el uso de OCT, los cuales contribuyen a la alteración y supresión de las señales de lípidos en la espectrometría de masas. Esto permite utilizar el enfoque DISC-3D para obtener imágenes de espectrometría de masas. Si bien la MSI es una técnica poderosa y emergente para caracterizar moléculas pequeñas, lípidos y proteínas en muestras biológicas, hasta ahora se ha limitado en gran medida al interrogatorio de cortes de tejido. Si bien investigadores anteriores han demostrado la MSI de núcleos de esferoides, ninguna técnica existente permitía la preservación de la morfología celular invasiva y proporcionaba la alta sensibilidad de espectrometría de masas necesaria para caracterizar el frente invasivo de los esferoides. Demostramos que el hidrogel bifuncional de colágeno I-gelatina dual que es fundamental en el protocolo DISC-3D apoya la invasión celular en 3D y permite la criosección mientras preserva el núcleo del esferoide, las células invasivas y la integridad, morfología y bioquímica de la matriz circundante. contexto. A su vez, junto con modificaciones a la instrumentación de MSI para mejorar la señal, demostramos imágenes a través del esferoide y medición local del contenido de lípidos en células invasivas. Por lo tanto, el protocolo DISC-3D abre la puerta a la obtención de imágenes basadas en lipidómica y metabolómica de células invasivas en particular, lo que podría generar nuevos conocimientos sobre las causas y los posibles tratamientos para la invasión y metástasis de células cancerosas.

El medio HyClone DMEM con alto contenido de glucosa y L-glutamina y la gelatina porcina tipo A 300 de concentración se adquirieron de Fisher Scientific (Waltham, MA). El suero bovino fetal y la solución de aminoácidos no esenciales MEM se obtuvieron de Gibco (Waltham, MA). Accutase y penicilina-estreptomicina-anfotericina B, 100X se adquirieron de MP Biomedicals (Solon, OH). El colágeno bovino tipo I tratado con pepsina (PT) se obtuvo de Advanced BioMatrix (San Diego, CA) como una solución de 5,9 a 6,1 mg/ml. El colágeno tipo I de cola de rata solubilizado en ácido (AS) y la solución de recuperación celular se obtuvieron como una solución de 10 mg/ml de Corning (Corning, NY). Colorante ATTO 647N (con funcionalidad éster de N-hidroxisuccimida (NHS); λex = 646 nm, λem = 664 nm), dimetilsulfóxido (DMSO), DAPI, urea 8 M, ácido acético (99,7%) y poli-l-lisina La solución se adquirió de Sigma Aldrich (St Louis, MO). BME/Matrigel sin rojo fenol y con factor de crecimiento reducido se obtuvo como una solución de 8,9 a 12 mg/ml de BD Biosciences (San José, CA). La solución de DMEM (10 ×), NaOH (1 N) y la solución de bicarbonato de sodio (7,5%) se adquirieron de Sigma Aldrich y se filtraron de forma estéril antes de su uso. Tampón Gibco de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) (1 M), microesferas TetraSpeck (0,1 µm, azul/verde/naranja/rojo oscuro fluorescente) y FluoroEsferas (modificadas con carboxilato, fluorescente rojo Nilo 2 de 1 µm) % sólido) se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA) y se filtraron de forma estéril antes de su uso. El fosfato de formalina tamponado (10%), la albúmina sérica bovina (BSA), el agua (grado LC-MS), el metanol (grado LC-MS) y el ácido fórmico (99%) se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Triton-X se obtuvo de Merck Millipore Chemicals (Billerica, MA). Los anticuerpos anti-integrina β1 conjugados con AlexaFluor488 (clon P5D2, tinción total β1) y el anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con AlexaFluor647 se obtuvieron de Abcam (Cambridge, MA). El éster NHS AlexaFluor 555 y la faloidina conjugada con AlexaFluor se obtuvieron de Molecular Probes de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). El anticuerpo conjugado MT1-MMP AlexaFluor488 se obtuvo de R&D Systems (Minneapolis, MN). El anticuerpo anti-p53 y el anticuerpo anti-RhoA fueron un regalo del laboratorio de Carol Prives (Universidad de Columbia, Nueva York). Se adquirió tampón tris HCl 1 M de Lonza Accugene (Morristown, Nueva Jersey). El medio de montaje Vectashield se adquirió a través de Vector Laboratories (Burlingame, CA).

Se adquirieron portaobjetos de microscopio previamente limpiados de 24 × 75 × 1 mm, cubreobjetos de vidrio de 24 × 40 y placas Nunclon Sphera de Fisher Scientific (Waltham, MA). Las placas de alta tolerancia (P35G-0,170-14-C) se obtuvieron de MatTek Corporation (Ashland, MA). Las placas fluoradas de 35 mm se obtuvieron de World Precision Instruments (Sarasota, Florida). Los insertos de cultivo de silicona para autoinserción se adquirieron en Idibi (Grafelfing, Alemania).

Las células de cáncer de mama MDA-MB-231 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células se cultivaron en DMEM con alto contenido de glucosa 1x que contenía suero bovino fetal al 10% (v/v), solución de antibióticos 100x al 1% (v/v) y solución de aminoácidos no esenciales al 1% (v/v) 100x. Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Las células se subcultivaron cuando se alcanzó una confluencia del 80 al 90 % y se utilizaron en los pasajes 3 a 20.

Los esferoides se generaron utilizando una modificación del protocolo descrito anteriormente.32 Específicamente, las células sembradas en plástico de cultivo de tejidos se separaron usando Accutase y se colocaron en medio de cultivo de crecimiento DMEM helado que contenía 0,2575 mg/ml de Matrigel (extracto de membrana basal), 1 × 10–. 4% (v/v) de fluoroesferas rojas del Nilo (según corresponda) y 5 × 104 células/ml, lo que da como resultado esferoides que contienen 10.000 células cada uno. Para los esferoides que contenían fluoroesferas, hubo una centrifugación inicial que contenía la mitad del medio de cultivo de crecimiento y las fluoroesferas. Después de esto, el medio de cultivo de crecimiento restante que contenía las células y Matrigel se pipeteó cuidadosamente sobre el medio de cultivo de células de crecimiento que contenía las fluoroesferas y la placa se centrifugó nuevamente. En ausencia de fluoroesferas, sólo se produce una única centrifugación que contiene todos los componentes mencionados anteriormente. La centrifugación se realizó en placas Nunclon Sphera de fondo en U de 96 pocillos con fijación ultrabaja a 4 ° C, 1000 G, durante 10 minutos. Se permitió que los esferoides se compactaran a 37 °C bajo 5% de dióxido de carbono durante 48 h.

Se generó colágeno I marcado fluorescentemente como se describió anteriormente.59,60 En resumen, el colágeno I de cola de rata AS se diluyó en una solución de 2 mg/mL en ácido acético 20 mM filtrado estéril y bicarbonato de sodio 0,01 M hasta un pH de ≈ 8. NHS Se añadió AlexaFluor555 modificado con éster a la solución de colágeno I para lograr la proporción de etiquetado deseada (generalmente 5 fluoróforos por monómero de colágeno I), y se dejó que la reacción se desarrollara a 4 ° C en la oscuridad durante 24 h. Luego se dializó la solución de colágeno marcada contra ácido acético 20 mM durante 3 días para eliminar cualquier colorante no unido. El colágeno I etiquetado se almacenó en la oscuridad a 4 °C durante un máximo de 6 meses.

Los geles de colágeno se prepararon a partir de una solución madre de monómero de colágeno tratado con pepsina bovina tipo I de alta concentración (5,9–6,1 mg/ml). Se generaron soluciones a partir de DMEM 10X al 10 % (v/v), tampón HEPES al 2,5 % (v/v), bicarbonato de sodio al 2,5 % (v/v) y agua de calidad para cultivo celular. Este procedimiento se realizó íntegramente en hielo a 4 °C para evitar el autoensamblaje del colágeno. Se añadió colágeno a la solución de manera que se obtuvo una concentración final de colágeno I de 1 mg/ml y la solución se ajustó a un pH de 7,4 usando NaOH. Se permitió que las soluciones gelificaran a 37 °C y 5% de dióxido de carbono durante 45 minutos a 1 h y posteriormente se cubrieron con medio de crecimiento de cultivo celular para evitar la deshidratación del gel. Se generaron geles con colágeno I marcado con fluorescencia de la misma manera, con la excepción de que se agregaron monómeros de colágeno marcados con fluorescencia en una proporción de 1:10 v/v al colágeno sin marcar.

Una vez preparadas, las soluciones se pipetearon en cámaras hechas a medida. Estas cámaras se construyeron a partir de insertos de cultivo celular sin el centro. Luego se unieron los insertos de cultivo celular a placas de cultivo celular con fondo de cubreobjetos mediante el adhesivo presente en los insertos. Se pipetearon 150 μl de solución en cada cámara y las cámaras se transfirieron rápidamente a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono durante 45 min a 1 h para permitir la gelificación. Posteriormente, los geles se cubrieron con 100 µl de medio de crecimiento de cultivo celular y se agregaron ≈ 600 µl de medio de crecimiento al área que rodeaba los geles para evitar la deshidratación del gel.

Se prepararon geles de colágeno con esferoides implantados como se describe anteriormente, con la adición de esferoides individuales a la solución antes de la gelificación. Antes de agregar los esferoides a la solución, los esferoides se colocaron en una solución de recuperación celular helada durante 45 a 60 minutos para eliminar cualquier Matrigel del exterior del esferoide que se acumulara durante la formación y compactación del esferoide. Durante este proceso, se prepararon y vertieron soluciones de colágeno como se describió anteriormente, de modo que después del tratamiento con Cell Recovery Solution se pudiera colocar un único esferoide en cada solución de colágeno individual. Luego se incubaron las soluciones y se cubrieron con medio de cultivo de crecimiento como se describe anteriormente.

Como se representa esquemáticamente en la Fig. 1 y la Fig. S1a, el protocolo DISC-3D comienza con la formación de esferoides centrifugando las células en presencia de extracto de membrana basal (Matrigel), como se describió anteriormente. La solución de esferoide se complementa con fluoroesferas Nilo Red (poliestireno, 1 μm de diámetro) antes de la centrifugación, que actúan como una señal visual para la ubicación del esferoide durante la criosección. Las fluoroesferas no afectan la capacidad invasiva de las células (Fig. S2). Después de la centrifugación, se permite que los esferoides se compacten durante 48 h y luego se implantan en soluciones de colágeno I de 1 mg/ml (Fig. S1a) y se transfieren a una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 para iniciar la gelificación del colágeno y mantener la salud celular. .

A partir de este punto, el protocolo DISC-3D tiene tres vías de preparación de muestras paralelas apropiadas para experimentos distintos (Fig. S1b-d). En los tres enfoques, se utiliza gelatina porcina tipo A al 10% (p/v) para formar una red secundaria. Toda la gelatina utilizada en este trabajo se esteriliza en autoclave antes de su uso. Esto disminuye el peso molecular promedio de la gelatina y la viscosidad de la solución de gelatina, permitiendo que la solución impregne la red de colágeno más fácilmente. Después del autoclave, las soluciones de gelatina se almacenaron a 37 °C antes de agregarlas a las muestras.

Para preparar muestras para obtener imágenes del núcleo del esferoide, se permitió que las muestras gelificaran a 37 °C y 5% de CO2 durante 1 h, momento en el que se fijaron y teñiron (Fig. S1b). Para preparar muestras para obtener imágenes del núcleo del esferoide y de las células invasoras, se permitió que los esferoides invadieran durante 48 h después de la implantación del colágeno I. En este punto, las muestras se fijaron y tiñeron (Fig. S1c). En ambos casos, después de la tinción (descrita en la sección "Inmunocitoquímica" a continuación), las muestras se cubrieron con 75 μL de PBS y 100 μL de gelatina al 10%. Se agregaron aproximadamente 600 µl de PBS al área que rodea los geles para evitar la deshidratación del gel. Una vez que la muestra se cubrió con gelatina, la muestra se incubó a 37 °C durante 24 h. Luego, la muestra se mantuvo a 4 °C durante 1 h para permitir la gelificación de la gelatina, después de lo cual la muestra se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta que se crioseccionó.

Se permitió que los esferoides invasivos preparados para imágenes de espectrometría de masas invadieran durante 24 h. En ese punto, los esferoides se cubrieron con gelatina porcina tipo A al 10% (p/v). Luego, las muestras se incubaron a 37 °C durante otras 24 h, permitiendo que las células continuaran migrando sin obstáculos a medida que la gelatina se difundía a través de la muestra (Fig. .S2). Después de este período de incubación, las muestras se enfriaron a 4 °C durante 1 h para permitir la gelificación de la gelatina. Luego, la muestra se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta que se crioseccionó.

Una vez que los geles de colágeno sin células se gelificaron completamente a 37 °C (1 h), se cubrieron con 75 μl de PBS y 100 μl de gelatina al 10%. Luego, la muestra se incubó a 37 °C durante 24 h, se gelificó a 4 °C durante 1 h, se congeló instantáneamente y se almacenó a -80 °C hasta la criosección.

Las muestras preparadas en esta etapa generalmente son viables hasta por 1 mes cuando se almacenan en un recipiente hermético a -80 °C y pueden usarse hasta por 6 meses, pero escalas de tiempo más largas dan como resultado muestras más secas y, por lo tanto, un mayor agrietamiento de la muestra durante criosección.

Las muestras se crioseccionaron en un criostato Leica CM3050 S con la cámara y el portamuestras mantenidos a -20 °C. Las temperaturas inferiores a -20 °C tendieron a provocar el agrietamiento de la muestra, y las temperaturas superiores a -20 °C aumentaron la probabilidad de que la muestra se adhiera a la etapa, lo que inhibe el corte limpio. Se dejó que las muestras se calentaran a -20 °C durante al menos 20 minutos antes del corte para evitar fracturas. Los espaciadores de cultivo celular de silicona que contenían las muestras gelificadas se separaron de la placa de cultivo celular inclinando con cuidado la muestra fuera de la placa, ya que sacar las muestras de la placa a menudo provocaba que la muestra se agrietara. Luego se retiraron las muestras de los espaciadores de silicona y se montaron en el mandril utilizando agua de calidad para espectrometría de masas.

Las muestras se montaron de manera que la orientación del gel en el plato imitara la orientación del gel en la placa de cultivo celular (es decir, el fondo del gel sigue siendo el fondo en ambos escenarios). Las muestras se recortaron según la región de interés (utilizando la señal visual de las fluoroesferas rojas del Nilo cuando correspondiera). Luego, las muestras se cortaron hasta obtener el espesor deseado: 4 µm para geles de colágeno solo y 10 µm para geles de colágeno que contenían esferoides. Las rodajas de colágeno I tenían tendencia a adherirse a las superficies y arrugarse, lo que hacía que el uso del protector antivuelco incorporado en el criostato fuera un desafío. Como tal, se evitó que la muestra rodara guiando cuidadosamente las rebanadas cortadas de la muestra usando un pincel de punta suave. Luego, las muestras se transfirieron a los portaobjetos de vidrio apropiados, nuevamente usando un pincel de punta suave (portaobjetos de microscopio prelimpiados de 24 × 75 × 1 mm para imágenes de espectrometría de masas, cubreobjetos de vidrio de 24 × 40 × 0,13–0,17 para imágenes de microscopía y 35 mm). platos de alta tolerancia P35G-1.0-14-C para microscopía de súper resolución). Después de la crioseccion, las muestras se pueden almacenar en un recipiente hermético a -80 °C hasta que estén listas para su uso. Hasta la fecha, no se ha observado degradación de la muestra en el congelador a -80 °C, ni siquiera en el caso de muestras almacenadas hasta por 1 año. Una vez listas para su uso, las muestras deben secarse en un desecante al vacío durante al menos 10 minutos. Después del secado, las muestras se pueden teñir y etiquetar más, como se describe a continuación.

Después de la formación e implantación de los esferoides, los esferoides se fijaron en el momento de 1 h con formalina al 4% precalentada durante 20 minutos. Luego se enjuagaron los esferoides tres veces durante 10 minutos con 1X PBS. A continuación, los esferoides se permeabilizaron durante 10 minutos en una solución de Triton-X al 0,02%, seguido de un enjuague rápido, dos remojos de 10 minutos y un remojo de 30 minutos, todo en PBS 1X. Luego se tiñeron y se tomaron imágenes de los esferoides como se describe a continuación.

La integrina anti-β1 AlexaFluor488 (clon P5D2) se tiñó a una concentración de 1:200 (v/v), la faloidina AlexaFluor 647 se tiñó a una concentración de 1:1000 (v/v) y DAPI a una concentración de 1: 1000 (v/v). Las muestras se tiñeron durante la noche en la oscuridad a 4 °C y posteriormente se enjuagaron tres veces durante 10 minutos con 1X PBS. Las muestras se superpusieron con 100 μl de PBS 1 × y luego se tomaron imágenes (mientras aún estaban en 3D) en el Zeiss LSM800 usando un objetivo de 20 ×. Se tomaron pilas en Z a intervalos de 10 μm tan altos como lo permitiera la distancia de trabajo del objetivo. Luego, las muestras se cubrieron con gelatina y PBS, se congelaron y se crioseccionaron (Protocolo DISC-3D Parte 2). Se tomaron imágenes de cada corte (normalmente, ≈ 50) del esferoide en el Zeiss LSM800 utilizando el objetivo de 20x. Luego, cada una de estas rebanadas se volvió a teñir usando los mismos tintes y concentraciones enumerados anteriormente. Se colocaron aproximadamente 20 µl de la solución de tinción encima de cada rebanada individual del esferoide crioseccionado y se dejaron reposar las muestras durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada y sellada (para reducir la evaporación de la solución de tinción). Las muestras se enjuagaron a la mañana siguiente tres veces en PBS 1X durante 10 minutos, se secaron por completo y se tomaron imágenes nuevamente de cada corte como se describe anteriormente.

Los esferoides se tiñeron con integrina anti-β1 AlexaFluor488 (clon P5D2) a una concentración de 1:200 (v/v) y DAPI a una concentración de 1:1000 (v/v). Las muestras se tiñeron durante la noche en la oscuridad a 4 °C y posteriormente se enjuagaron tres veces durante 10 minutos con 1X PBS. Las muestras se cubrieron con gelatina y se crioseccionaron como se describe en la Parte 2 del protocolo DISC-3D. Las imágenes de las muestras crioseccionadas se obtuvieron en el Zeiss LSM800 usando el objetivo de 20x. Luego, las muestras se almacenaron en una caja desecada hermética a 4 °C durante 10 meses. La muestra se calentó a temperatura ambiente y luego se tiñó con faloidina AlexaFluor 647 a una concentración de 1:1000 (v/v). El tinte se añadió a razón de 20 µl por corte crioseccionado y se dejó reposar en una cámara humidificada sellada a 4 °C durante la noche. Posteriormente, la muestra se lavó tres veces en 1X PBS durante 5 min. Después del corte, se tomaron imágenes de todas las muestras en el Zeiss LSM800 Airyscan con el objetivo de aceite de 63x.

Se generaron muestras de esferoides invasivos (todos preparados siguiendo el protocolo DISC-3D descrito en la Fig. S1c) como se describió anteriormente y se fijaron después de 48 h de invasión. El medio de crecimiento del cultivo celular se eliminó de los geles. Luego, los geles se fijaron durante 20 minutos usando formaldehído libre de metanol al 4% precalentado en PBS 1x durante 20 minutos, seguido de tres enjuagues de 10 minutos con PBS. Luego, las muestras se permeabilizaron usando Triton-X al 0,02% en PBS 1X durante 10 minutos. Luego se retiró el Triton-X y las muestras se enjuagaron rápidamente con PBS y luego se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS 1X, seguido de un remojo de 30 minutos en PBS 1X. Luego, las muestras se tiñeron como se describe a continuación en 100 µl de PBS 1X por cámara y durante la noche a 4 °C, a menos que se indique lo contrario. Después de la tinción, las muestras se enjuagaron tres veces con 1× PBS durante 10 minutos y se cubrieron con 75 µl de 1× PBS. Luego, las muestras se cubrieron con gelatina y se crioseccionaron siguiendo los procedimientos descritos anteriormente (Protocolo DISC-3D Parte 2). Después del corte, se tomaron imágenes de todas las muestras en el Zeiss LSM800 en modo Airyscan utilizando el objetivo de aceite de 63 ×.

El anticuerpo anti-RhoA conjugado directamente se usó a una concentración de 1:100 (v/v) y DAPI a una concentración de 1:1000 (v/v). Después de estas tinciones, las muestras se lavaron tres veces durante 10 minutos en PBS 1X y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en una solución de BSA al 2%. Posteriormente, las muestras se tiñeron con un anticuerpo secundario utilizando una IgG monoclonal de ratón marcada fluorescentemente con ATTO 647 a una concentración de 1:100 v/v en una solución de BSA al 2 % a temperatura ambiente durante una hora. Luego, las muestras se trataron como se describe en "Inmunocitoquímica y etiquetado de esferoides invasivos fijos".

El anticuerpo anti-p53 conjugado directamente se usó a una concentración de 1:1 (v/v), y se añadió DAPI a una concentración de 1:1000 (v/v). Luego, las muestras se lavaron tres veces durante 10 minutos en PBS 1X y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en una solución de BSA al 2%. Posteriormente, las muestras se tiñeron con un anticuerpo secundario utilizando una IgG monoclonal de ratón marcada fluorescentemente con ATTO 647 a una concentración de 1:100 v/v en una solución de BSA al 2 % a temperatura ambiente durante una hora. Luego, las muestras se trataron como se describe en "Inmunocitoquímica y etiquetado de esferoides invasivos fijos".

Se aplicó el anticuerpo MT-MMP-1 AlexaFluor 488 a una concentración de 1:10 (v/v) y se tiñó DAPI a una concentración de 1:1000 (v/v). Luego, las muestras se trataron como se describe en “Inmunocitoquímica y etiquetado de esferoides invasivos fijos”.

La microscopía óptica se realizó en uno de los cuatro microscopios. Para la Fig. S2 se utilizó un microscopio de barrido láser confocal invertido Olympus Fluoview 300 con un objetivo de aire de 10 × (NA 0,4). Se utilizó un microscopio de escaneo láser confocal invertido Zeiss LSM700 con un objetivo de aceite de 63 × (NA 1.4) para las imágenes etiquetadas como "confocales" en la Fig. 4a y la Fig. S7. Se utilizó un microscopio de barrido láser confocal Zeiss LSM800 de 63 × aceite (NA 1.4) para las Figs. 2a – c, 6 y Fig. S3. Para la Fig. 3a, se utilizó un microscopio de barrido láser confocal Zeiss LSM800 con un objetivo de 10 × (NA 0,4). Ese mismo microscopio en modo Airyscan con aceite 63× (NA 1.4) se utilizó para las Figs. 3b – d, f – h, 4a, S5 y S7 para imágenes etiquetadas como "Airyscan". Se utilizó un microscopio Zeiss Elyra 7 de aceite 63 × (NA 1.46) en modo de campo amplio, modo SIM de celosía o modo TORMENTA, según fuera necesario para las figuras 4a y S7.

Las imágenes de Airyscan se obtuvieron en un microscopio confocal invertido Zeiss LSM800 con un objetivo de aceite de 63 × (NA1.4) equipado con un detector GaAsP-PMT. Se utilizaron configuraciones óptimas para el tamaño de píxel, la velocidad de escaneo y el área de escaneo según lo definido por el software ZeissZen Blue. Después de la recolección de imágenes, las imágenes se procesaron utilizando la herramienta de procesamiento Airyscan en el software ZeissZen Blue.

Las imágenes SIM se obtuvieron en un microscopio Zeiss Elyra 7 equipado con SIM de celosía utilizando un objetivo de aceite de 63 × (NA 1.46), una lente de aumento adicional de 1.6 × y una cámara sCMOS pco.edge 4.2. Se utilizaron configuraciones óptimas para la resolución de rejilla y pila z según lo definido por el software ZeissZen Black. Las imágenes SIM se reconstruyeron utilizando la configuración predeterminada en el software ZeissZen Black.

Para obtener imágenes STORM, se preparó un tampón de imágenes como se describió anteriormente.61 En resumen, se preparó un tampón Tris 1 M, pH 8,0. El medio de montaje Vectashield H1000 se diluyó en glicerol al 95 % (v/v) para producir una concentración final de medio de montaje al 25 % (v/v). Se añadió tampón Tris para producir una concentración final de Tris 50 mM en el tampón de imágenes completo. Las imágenes STORM se adquirieron en un Zeiss Elyra 7 equipado con un objetivo TIRF NA de 63 × 1,46 y una cámara sCMOS pco.edge 4,2. Las imágenes se recopilaron utilizando iluminación HILO. Las muestras se iluminaron con 100% de potencia láser para inducir el parpadeo del tinte con un láser de 561 nm (100 mW). Se adquirieron imágenes en más de 30.000 fotogramas con un tiempo de exposición de 20 ms. Las imágenes de STORM se reconstruyeron utilizando el complemento ThunderSTORM en FIJI con la configuración de análisis predeterminada. Los ajustes de la cámara para la reconstrucción se establecieron de acuerdo con las especificaciones del fabricante [tamaño de píxel = 97 nm, fotoelectrones por recuento A/D = 0,46, nivel base (recuentos A/D) = 97]. Las moléculas localizadas en imágenes reconstruidas se filtraron por intensidad (> 100 fotones) y desviación estándar del gaussiano ajustado (> 50 nm y < 250 nm) para eliminar el ruido y los ajustes de mala calidad. El ruido se redujo aún más mediante el uso de un filtro basado en DBSCAN para eliminar moléculas atípicas en regiones escasamente pobladas del área de imágenes (Epsilon = 50 nm, MinPts = 5). Después de estos pasos de posprocesamiento, las imágenes se corrigieron por deriva mediante correlación cruzada con un tamaño de contenedor de 5. Las moléculas en las imágenes posprocesadas y corregidas por deriva se visualizaron utilizando la representación "gaussiana normalizada" con una incertidumbre lateral establecida en 10 nm. .

Los esferoides preparados para imágenes de espectrometría de masas se formaron y se implantaron en geles de colágeno como se describe anteriormente, siguiendo el protocolo DISC-3D descrito en la figura S1d. Luego, las muestras se crioseccionaron en cortes de 10 μm de espesor y se obtuvieron imágenes MSI.

Se tomaron imágenes de las secciones en una etapa 2D de ionización por electropulverización (DESI) de desorción de Prosolia montada en el espectrómetro de masas SYNAPT HDMS G2-Si Q-ToF (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.). El DESI estaba equipado con un prototipo de pulverizador modificado de alto rendimiento de Waters y un prototipo de capilar de transferencia calentado para optimizar la transferencia de iones generados (Fig. S6). El disolvente de electropulverización consistía en metanol/agua/ácido fórmico (98:2:0,01; v/v/v) que contenía 40 pg/μl de leucina encefalina como masa de bloqueo interno. El caudal fue de 2 µl/min. El voltaje del capilar de pulverización se ajustó a 0,6 kV, el voltaje del cono fue de 50 V y la temperatura de la fuente de iones se ajustó a 150 °C. Los espectros de masas se adquirieron utilizando modos de ionización positiva y negativa con un rango de masas de m/z 50–1200 y un tamaño de píxel de 40 μm. La línea de transferencia calentada se ajustó a temperaturas que oscilaban entre 24 y 400 °C. Los datos espectrales de masas de la imagen de iones (características m/z correspondientes en cada píxel dentro de la imagen) de DESI MSI se procesaron para su visualización utilizando el software de imágenes de alta definición (HDI versión 1.6, Waters Corporation). Todas las imágenes se normalizaron con respecto a la corriente iónica total. Los iones lipídicos se anotaron buscando masas monoisotópicas en las bases de datos en línea Lipid MAPS con una tolerancia de masa de 5 ppm y haciendo coincidir los tiempos de deriva con los estándares disponibles.

Se realizaron imágenes correlativas a través de técnicas de microscopía óptica en hidrogeles libres de células tomados mediante el protocolo DISC-3D como se describe anteriormente (Fig. S7). Se tomaron imágenes de las muestras en orden en el Zeiss LSM700 (confocal), el Zeiss LSM800 en modo Airyscan, el Zeiss Elyra SIM y, finalmente, el Zeiss Elyra STORM. Toda la correlación de imágenes se realizó utilizando el complemento FIJI TurboReg62.

Los esferoides preparados tanto para imágenes de espectrometría de masas como para microscopía confocal se generaron e implantaron como se describió anteriormente (Fig. S1d) y se crioseccionaron como se describe en el protocolo DISC-3D, Parte 2. Después de la criosección y la adquisición de DESI MSI, los esferoides se fijaron usando formalina al 4%. durante 10 min, seguido de tres lavados de 5 min con PBS 1X. Luego, la muestra se tiñó con DAPI a una concentración de 1:1000 (v/v) en 1X PBS. Se colocaron aproximadamente 20 μl de la solución de tinte encima de cada corte crioseccionado. Las muestras se tiñeron durante la noche en la oscuridad a 4 °C en una cámara humidificada sellada. Posteriormente, las muestras se enjuagaron tres veces durante 5 minutos en 1X PBS. Se tomaron imágenes de cortes de esferoides en el microscopio Zeiss LSM800 con un aumento de 20 ×. La correlación de imágenes se realizó utilizando el complemento de registro FIJI TurboReg.

Todas las pruebas estadísticas se realizaron con un valor α de 0,05. La significación estadística se marcó mediante asteriscos, donde * denota ap < 0,05, ** denota ap < 0,01 y *** denota ap < 0,001. La falta de significación estadística (p > 0,05) se indica con una daga (†). A denota significancia estadística y se describe en el título de la figura correspondiente cuando se emplea.

Las distancias invasivas de los esferoides (Fig. S2) se determinaron utilizando imágenes de 10 × tomadas en Olympus Fluoview 300 en modo de transmitancia de escaneo en t = 1 h y t = 48 h después de la implantación de los esferoides. La distancia invasiva se definió como la circunferencia de un círculo que abarca al menos el 90% del frente invasivo del esferoide en t = 48 h, menos la circunferencia de un círculo que abarca completamente el núcleo del esferoide en t = 1 h.

La intensidad de fluorescencia a través del esferoide en esferoides 3D, crioseccionados, crioseccionados y vueltos a teñir (Fig. 2) se calculó en FIJI trazando una línea que divide el esferoide. El perfil de intensidad a lo largo de esta línea se normalizó a la intensidad máxima a lo largo de esa línea y gráfico. La intensidad de la señal normalizada se calculó para cada corte con imagen disponible: 12 cortes para la muestra 3D, 56 cortes para las muestras DISC-3D y 49 cortes para las muestras reteñidas con DISC-3D. Se determinó la intensidad promedio para cada corte y se representó como diagramas de caja y bigotes (Fig. 2i-k).

Las relaciones señal-fondo de imágenes 3D y crioseccionadas (Fig. 3) se determinaron dividiendo la intensidad máxima de las regiones de interés que abarcan las células (o el entorno extracelular local en el caso de MT1-MMP) entre la intensidad máxima de las regiones fuera de las células. y/o el entorno extracelular local.

Para determinar el ancho aparente de la fibra de colágeno (Fig. 4b), se dibujaron ROI a través de las fibras de colágeno perpendiculares a la dimensión más larga de la fibra. Los valores de intensidad de los píxeles se registraron a lo largo del ROI y el perfil de intensidad se ajustó a una función gaussiana de la forma:

Todos los ajustes con un valor de R2 ajustado por debajo de 0,95 se descartaron antes de realizar análisis adicionales. Se extrajo el ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de estas curvas y el valor medio definió el ancho aparente de la fibra.

La determinación de la resolución de microscopías de campo amplio, confocales, Airyscan y SIM se realizó midiendo el FWHM de la función de dispersión puntual de una fuente puntual. Específicamente, se depositaron perlas TetraSpeck (100 nm) sobre vidrio que primero se recubrió con poli-l-lisina al 0,01% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se eliminó la solución de poli-l-lisina y se dejó secar el portaobjetos de vidrio. Las perlas se diluyeron 1:200 en DIH2O, se sonicaron durante 5 minutos y luego se agitaron con vórtex. La solución de perlas se añadió al portaobjetos de vidrio y se dejó reposar durante 10 min. Se eliminó el exceso de solución y se tomaron imágenes de las perlas utilizando cada uno de los métodos de microscopía respectivos en configuraciones que reflejan las utilizadas para obtener imágenes de fibras de colágeno. La FWHM de la función de dispersión puntual de las perlas usando cada una de estas técnicas se determinó de la misma manera que se determinaron los anchos de las fibras de colágeno I. En resumen, las regiones de interés se dibujaron en el centro de la cuenta y la intensidad a través de las regiones de interés se ajustó a una curva gaussiana. El FWHM de la curva definió la resolución y el ancho mínimo esperado de fibra asociado con cada técnica.

La resolución de las imágenes STORM se determinó utilizando:

como se describe en Ref.53. La precisión de la localización se calculó en el complemento ThunderSTORM de FIJI, siguiendo el protocolo descrito en la Ref.63. La resolución de Nyquist se calculó utilizando el protocolo descrito en la Ref.64, que relaciona la resolución de la imagen con la densidad de localización de la imagen. La figura S4d muestra el cambio en la resolución y el ancho aparente de la fibra de colágeno (utilizando el método descrito anteriormente) en función del número de fotogramas incluidos en el análisis. Ambas cantidades se acercan a mesetas en aproximadamente 20.000 fotogramas, lo que respalda la elección de 30.000 fotogramas como número utilizado para las imágenes STORM y su análisis.

El tamaño de los poros se determinó utilizando el método descrito en la Ref.65. Para reducir cualquier posible sesgo, se utilizó el mismo flujo de trabajo de procesamiento de imágenes para todos los contextos de imágenes (a través de técnicas de microscopía y 3D alto/bajo frente a DISC-3D). En ImageJ, las imágenes sin procesar se sometieron a un filtro de paso de banda y a una resta de fondo de bola rodante para eliminar características por debajo de un cierto umbral de tamaño y reducir la señal de fondo fuera del plano, respectivamente. Luego, las imágenes se sometieron a un umbral local automático para obtener una imagen binarizada. Para determinar el tamaño de los poros, las distancias entre los píxeles "encendidos" se contaron fila por fila y columna por columna en la imagen segmentada. La distribución de estos espacios entre fibras se ajustó a la función de densidad de probabilidad exponencial:

El tamaño de poro informado para la red es el tamaño de poro característico 1/λ.

Los datos estarán disponibles previa solicitud.

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Los autores agradecen al Dr. Gregory Roman y al Dr. Roy Martin (Waters Corporation) por proporcionar el prototipo del rociador y el tubo de transferencia calentado. Los autores agradecen al Centro Oncológico Integral Herbert Irving (P30CA013696) por el Premio Piloto Conjunto que financió parcialmente este trabajo. Los autores reconocen el uso de instrumentos en el Centro de Imágenes del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Columbia y en el Centro de Caracterización Biomolecular de Precisión y en el Centro Central de Espectrometría de Masas del Departamento de Química de la Universidad de Columbia.

Departamento de Química, Universidad de Columbia, Nueva York, NY, 10027, EE. UU.

Rachel C. Avard, Megan L. Broad, Fereshteh Zandkarimi, Alexander J. Devanny, Joseph L. Hammer, Karen Yu y Laura J. Kaufman

Departamento de Química, Universidad de Cardiff, Cardiff, CF10 3AT, Gales, Reino Unido

Megan L. amplio

Departamento de Física, Universidad de Columbia, Nueva York, NY, 10027, EE. UU.

karen yu

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Columbia, Nueva York, NY, 10027, EE. UU.

Asja Guzmán

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RCA: Administración de Proyectos, Conceptualización, Metodología, Investigación, Análisis formal, Visualización, Redacción-borrador original. MLB: Investigación, Análisis Formal, Visualización. FZ: Metodología, Investigación, Análisis formal, Visualización, Escritura—borrador original. AJD: Metodología, Investigación, Análisis Formal, Visualización, Software, Escritura: revisión y edición. JLH: Metodología, Investigación, Análisis Formal, Visualización, Software. KY: Investigación. AG: Conceptualización. LJK: supervisión, administración de proyectos, conceptualización, adquisición de fondos, metodología, recursos, redacción: borrador original, revisión y edición.

Correspondencia a Laura J. Kaufman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Avard, RC, Broad, ML, Zandkarimi, F. et al. DISC-3D: el sistema de hidrogel dual mejora las imágenes ópticas y permite obtener imágenes de espectrometría de masas correlativas de esferoides tumorales multicelulares invasores. Representante científico 13, 12383 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38699-1

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Recibido: 17 de abril de 2023

Aceptado: 13 de julio de 2023

Publicado: 31 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38699-1

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